凍存管的使用是一門(mén)學(xué)問(wèn)，并不是打開(kāi)液氮罐、放入凍存管、關(guān)上液氮罐這樣簡(jiǎn)單的三部曲可以完成的。科學(xué)正確地使用凍存管，可以避免樣本的損失，并保護(hù)試驗(yàn)人員的安全。

Greiner 凍存管有IATA航空運(yùn)輸協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試證書(shū)，常規(guī)儲(chǔ)存細(xì)胞培養(yǎng)物，組織樣品，微生物樣品(如病毒，細(xì)菌，酵母，真菌，孢子等)，人源或動(dòng)物源其它生物樣品(如血液，血清，精液，抗體，RNA, DNA和蛋白樣本)，不適合存儲(chǔ)再生醫(yī)學(xué)樣本。

冷凍步驟

用預(yù)熱的PBS溶液洗滌細(xì)胞，吸取溶液，含有胰蛋白酶和EDTA的溶液覆蓋細(xì)胞(薄薄的液層足夠，胰蛋白酶和EDTA的濃度需要根據(jù)細(xì)胞系確定)。

37℃孵育細(xì)胞3-5分鐘。

細(xì)胞從底部脫離之后，終止孵育，加入含有血清的培養(yǎng)基，用移液器輕輕地懸浮細(xì)胞。

離心細(xì)胞懸液(500 x g, 5分鐘)，用含有血清的培養(yǎng)基重新懸浮。

細(xì)胞計(jì)數(shù)。

離心細(xì)胞懸液(500 x g, 5分鐘)，去除上清液，用適量體積的含有血清的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。

以1:1體積比混合細(xì)胞和凍存液(60%培養(yǎng)基，20%胎牛血清，20% DMSO)，然后轉(zhuǎn)移到Cryo.sTM凍存管中。凍存的細(xì)胞密度為 1-5×106 個(gè)/毫升。

含有細(xì)胞的Cryo.sTM凍存管建議以?1 K / min 的速率降溫，可以將凍存管置于?70℃含有異丙醇的容器中。如果Cryo.sTM凍存管存儲(chǔ)其他樣品，可以直接放置在?20℃，?70℃或者液氮的氣相。為了確保樣品冷凍均勻，4 mL和5 mL的Cryo.sTM凍存管需要先置于在?20℃冰箱過(guò)夜，然后再轉(zhuǎn)移到?70℃或者液氮的氣相。

然后轉(zhuǎn)移Cryo.sTM凍存管到液氮罐。為了避免污染(如支原體)和安全考慮，請(qǐng)將Cryo.sTM凍存管置于液氮的氣相，切勿置于液相。

解凍步驟

從液氮罐取出凍存的細(xì)胞后立即置于37℃水浴搖晃Cryo.sTM凍存管1-2分鐘。解凍過(guò)程需要越快越好。

轉(zhuǎn)移解凍的細(xì)胞于15 mL離心管，立即用大量的含有血清的細(xì)胞培養(yǎng)基混勻。

500 x g離心細(xì)胞5 分鐘，去除上清液，用適量的含有血清的細(xì)胞培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

按照建議的細(xì)胞濃度接種。

接下來(lái)的12小時(shí)細(xì)胞進(jìn)入靜默期。

間隔24小時(shí)和48小時(shí)更換培養(yǎng)基

如果細(xì)胞感染了新冠病毒，也可以參考以上步驟進(jìn)行冷凍存儲(chǔ)和解凍的操作。