分光光度法是指應用分光光度計的分析方法，因其具有靈敏、準確、快速及選擇性好等特點被廣泛應用于實驗室的元素分析，分光光度計的使用雖然簡單，但是其原理及一些基礎知識想必有許多小伙伴也是不了解的，今天整理了一部分分享給大家，希望能對你有所幫助。

  原理

  1、物質對光的選擇性吸收

  當光束照射到物質上時，光與物質發生相互作用，產生反射、散射、吸收或透射。若被照射的是均勻溶液，光的散射可以忽略。

      (1)溶液顏色的產生

  當一束白光通過某一有色溶液時，一些波長的光被溶液吸收，另一些波長的光則透過溶液。透射光或反射光刺激人眼使人感到顏色的存在。人把自身能感覺到的光定義為可見光。在可見光區，不同波長的光呈現不同的顏色，因此溶液的顏色由透射光的波長所決定。透射光與吸收光可組成白光，故稱這兩種光互為補色光，兩種顏色互為補色。

  (2)光吸收的本質

  當一束光照射到某物質或其溶液時，組成該物質的分子、原子或離子與光子發生“碰撞”，光子的能量就轉移到分子、原子或離子上，是這些粒子由最低能態(基態)躍遷到較高能態(激發態)，這個作用稱為物質對光的吸收。

  被激發的粒子約在10-8s后回到基態，并以熱或熒光等形式釋放出能量。分子、原子或離子具有不連續的量子化能級，僅當照射光光子的能量hυ，與被照射物質粒子的基態和激發態能量之差相當時，才能發生吸收。不同物質微粒由于結構不同而具有不同的量子化能級，其基態和激發態能量差也不相同。所以物質對光的吸收具有選擇性。

  (3) 吸收曲線

  吸收曲線，也稱為吸收光譜，描述了物質對不同波長的光的吸收能力。將不同波長的光透過某一固定濃度和厚度的有色溶液，測量每一波長下有色溶液對光的吸收程度(即吸光度)，然后以波長為橫坐標，以吸光度為縱坐標作圖，繪制的曲線即為吸收曲線。

  不同濃度的同一物質，在吸收峰附近的吸光度隨著濃度增加而增大，但最大吸收波長不變。若在最大吸收波長處測定吸光度，則靈敏度最高。因此，吸收曲線是分光光度法中選擇測定波長的重要依據。

  2、光吸收基本定律

  即朗伯-比爾定律：

  當一束平行單色光通過液層厚度為b的有色溶液時，溶質吸收了光能，光的強度就要減弱。溶液的濃度越大，通過的液層厚度越大，入射光越強，則光被吸收的越多，光強度的減弱也越顯著。該定律是紫外可見分光光度法等各類吸光光度法定量分析的依據，是由實驗觀察得到的，不僅適用于溶液，也適用于其他均勻非散射的吸光物質。

  A=lg(I/I0)=εbc

  A-吸光度;

  I0-入射光強度，cd;

  I-透射光強度，cd;

  ε-吸光系數，L/(mol˙cm);

  b-液層厚度(光程長度)，cm;

  c-有色溶液的濃度，mol/L。

  其物理意義為：當一束平行單色光通過單一均勻、非散射的吸光物質溶液時，溶液的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。

  式中ε是吸光物質在特定波長和溶劑的情況下的一個特征常數，數值上等于濃度為1mol/L的吸光物質在1cm光程中的吸光度。ε是吸光物質吸光能力的量度，ε值越大，方法的靈敏度越高。由實驗結果計算ε時，常以被測物質的總濃度代替吸光物質的濃度，實際上時表觀摩爾吸光系數。在多組分體系中，如果各種吸光物質之間沒有相互作用，體系的總吸光度等于各組分吸光度之和，即吸光度具有加和性。

  透光度T是透射光強度I與入射光強度I0之比，即：

  T=I/I0

  因此：A=lg(1/T)

  主要部件

  盡管光度計種類型號繁多，但它們都是由相同的基本部件組成的，包括光源、單色器、吸收池和檢測系統。

  1、光源

  在測量吸光度時，要求光源發出所需波長范圍內的連續光譜，要具有足夠的光強度，并在一定時間內能保持穩定。

  在可見光區測量時，通常使用鎢絲燈作為光源。鎢絲加熱到白熾狀態時會發出波長在320~2500nm之間的連續光譜。鎢絲燈工作溫度一般為2600~2870K，熔點為3680K。鎢絲燈的溫度決定于電源電壓，電源電壓的微小波動會引起鎢燈光強度的很大變化，因此必須使用穩壓電源。

  在紫外區測量時，常采用氫燈或氘燈產生波長在180~375nm之間的連續光譜作為光源。其理想光源應具有覆蓋整個紫外可見光區的連續輻射，強度應比較高，且隨波長變化能量變化不大，但在實際上難以實現。氘燈輻射強度比氫燈高2~3倍，壽命也比較長。氙燈的強度一般高于氫燈，但欠穩定，波長范圍180~1000nm，常用作熒光分光光度計的激發光源。

  2、單色器

  單色器是將光源發射的復合光分解為單色光的裝置。

  一般由5部分組成：入光狹縫、準光氣(一般由透鏡或凹面反光鏡使入射光成為平行光束)、色散器、投影器(一般由一個透鏡或凹面鏡將分光后的單色光投影至出光狹縫)、出光狹縫。

  色散器是單色器的核心部分，常用的色散元件是棱鏡或光柵。

  棱鏡由玻璃或石英制成，玻璃棱鏡色散能力強，但吸收紫外光，只能用于350-820nm波長的分析測定，在紫外區必須用石英棱鏡。

  光柵的特點是：色散均勻，呈線性，光度測量便于自動化，工作波段廣。

  3、吸收池

  也稱為比色皿，是盛放樣品溶液的容器，具有兩個互相平行、透光且具有精確厚度的平面。

  玻璃吸收池光程長度一般為1cm，也有0.1-10cm的。

  由于吸收池厚度存在一定誤差，其材質對光不是完全透明，在做定量分析時，對吸收池應做配套性試驗，試驗后標記出放置方向。

  紫外光區數值不跳為石英。

  4、檢測系統

  檢測系統包括檢測器和記錄顯示裝置。

  檢測器是一種光電轉換設備，將光強度轉變為電信號顯示出來。

  常用的檢測器有光電池、光電倍增管和光二極管陣列檢測器等。

  光電池的光電流較大，不用放大，用于初級的分光光度計上，疲勞效應嚴重。

  光電倍增管利用二次電子發射來放大光電流，放大倍數可高達108倍，應用最為廣泛。

  光二極管陣列檢測器由于全部波長同時被檢測，掃描速度快，可在0.1s內完成對190-800nm波長范圍的掃描。

  記錄顯示裝置包括放大器和結果顯示裝置。70年代采用數字讀出裝置。現代在主機中裝備有微處理機或外接微型計算機，控制儀器操作和處理測量數據，裝有屏幕顯示、打印機和繪圖儀等。