細胞培養(yǎng)基(cell culture medium)是人工模擬動物細胞的體內生長環(huán)境，維持體外細胞存活和增殖的營養(yǎng)物質基礎，其主要功能是為細胞提供適宜的pH和滲透壓，以及細胞本身不能合成的各種營養(yǎng)物質。本文將對細胞培養(yǎng)基的種類、成分及理化性質，以及相關問題等方面進行介紹。

  1. 細胞培養(yǎng)基的種類

  按照細胞培養(yǎng)基的發(fā)展歷史，細胞培養(yǎng)基大致可分為平衡鹽溶液、天然細胞培養(yǎng)基、合成細胞培養(yǎng)基、無血清細胞培養(yǎng)基、限定化學成分細胞培養(yǎng)基等幾大種類。

  1.1 平衡鹽溶液(balanced salt solution，BSS)

  BSS主要是由無機鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。其主要用于細胞的漂洗、配制其他試劑等。幾種常用的BSS配方如下(表1-1)。

  D-Hank's與Hank's的一個主要區(qū)別是前者不含有Ca2+和Mg2+，因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。因為Ca2+、Mg2+是細胞膜的重要組成成份，參與細胞粘附等功能，使用不含Ca2+、Mg2+的BSS可避免細胞結團。此外，Hanks液和Earle液是常用的BSS基礎溶液，前者緩沖能力較弱，適合于密閉培養(yǎng);后者緩沖能力較強，適合于5% CO2的培養(yǎng)條件。

  表1-1 幾種常用的BSS配方(g/L)

  1.2 天然細胞培養(yǎng)基

  天然培養(yǎng)基指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。其優(yōu)點是營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果良好，但缺點是成分復雜，來源受限且制作過程復雜、批間差異大。目前廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液、促進細胞貼壁的膠原類物質在培養(yǎng)某些特殊細胞也是必不可少。

  水解乳蛋白是乳白蛋白經蛋白酶和肽酶水解的產物，含豐富的多肽、氨基酸和碳水化合物。一般配制成0.5 %溶液(采用平衡鹽溶液溶解)與合成培養(yǎng)基(如MEM細胞培養(yǎng)基)以1:1的比例混合使用。

  目前用于細胞培養(yǎng)的血清主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。牛血清對絕大多數(shù)哺乳動物細胞都是適合的，但并不排除在培養(yǎng)某種細胞時使用其他動物血清更合適。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等，這些物質對促進細胞生長或抑制生長活性是達到生理平衡的。此外，血清含一些對細胞產生毒性的物質，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細胞的多胺反應(如精胺、亞精胺)形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長，甚至造成細胞死亡。目前，血清多作為一種添加成分與合成培養(yǎng)基混合使用，使用濃度一般為5 ~ 20 %，最常用是10 %。

  由于水解乳蛋白和血清成份復雜，批間差異大及存在病毒等外源污染風險，對下游生物制品的分離純化和安全性都存在較大的影響，在生物制藥行業(yè)的使用也越來越少。因此，基于對血漿成份的分析，合成細胞培養(yǎng)基應運而生。

  1.3 合成細胞培養(yǎng)基

  合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學物質模擬合成、人工設計、配制的培養(yǎng)基。最早開發(fā)的基礎培養(yǎng)基(minimal essential medium, MEM)，其本質為含有鹽、氨基酸、維生素和其他必需營養(yǎng)物的pH緩沖的等滲混合物。在此基礎上，DMEM、IMDM 、HAM F12、PRMI1640等各種合成細胞培養(yǎng)基被不斷開發(fā)出來。常用合成培養(yǎng)基的配方此處不詳細介紹，其特性及應用的范圍見表1-2。

  表1-2 常用合成培養(yǎng)基的特性及應用的范圍

  與天然培養(yǎng)基相比，有些天然的未知成分尚無法用已知的化學成分所替代，因此，細胞培養(yǎng)中使用合成培養(yǎng)基時必須加入一定量的天然培養(yǎng)基成分，以克服合成培養(yǎng)基的不足。最普遍的做法是添加5 ~ 10 %的血清，這樣才能維持細胞活力，促進細胞增殖。針對不同的動物細胞，現(xiàn)已開發(fā)了多種商業(yè)化、個性化的低血清細胞培養(yǎng)基配方，營養(yǎng)成份更加豐富，血清使用量可降低至1～3 %，由此可減少了血清等動物來源成份對生物制品安全性的影響。

  1.4 無血清細胞培養(yǎng)基(serum free medium，SFM)

  經歷了天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后，無血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)成為當今細胞培養(yǎng)領域的一大趨勢。采用無血清培養(yǎng)可降低生產成本，簡化分離純化步驟，避免病毒污染造成的危害。無血清培養(yǎng)基，一般是在合成培養(yǎng)基的基礎上，加入成份完全明確的或部分明確的血清替代成份，達到既能滿足動物細胞培養(yǎng)的要求，又能有效克服使用血清所帶來問題的目的。

  無血清培養(yǎng)基中通常需要添加一些額外的組分，才能幫助細胞貼壁生長，包括以下幾大類物質：

  1)促貼壁物質：一般為細胞外基質，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細胞功能的分化因子，對許多細胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖連蛋白主要促進來自中胚層細胞的貼壁與分化，這些細胞包括成纖維細胞、肉瘤細胞、粒細胞、腎上皮細胞、腎上腺皮質細胞、CHO細胞、成肌細胞等。

  2)促生長因子及激素：針對不同細胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細胞生長、維持細胞功能的重要物質，有些激素是許多細胞必不可少的，如胰島素。

  3)酶抑制劑：培養(yǎng)貼壁生長的細胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養(yǎng)基中需含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達到保護細胞的目的。最常用的是大豆胰酶抑制劑。

  4)結合蛋白和轉運蛋白：常見如轉鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加量比較大，可增加培養(yǎng)基的粘度，保護細胞免受機械損傷。許多旋轉式培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白。

  5)微量元素：硒是最常見的。

  1.5 無蛋白無血清細胞培養(yǎng)基與化學組份限定無血清細胞培養(yǎng)基

  1)無蛋白無血清細胞培養(yǎng)基(protein free midium, PFM)

  這類培養(yǎng)基完全不含有動物來源蛋白，但仍有部份添加物是植物蛋白的小水解片段或合成多肽片段，以及類固醇激素和脂類前體等，以替代動物激素、生長因子的作用。其特點是完全沒有蛋白或蛋白含量極低，有利于生物制品的分離純化。

  2)化學組份限定無血清細胞培養(yǎng)基(Chemically defined media, CDM)

  此類培養(yǎng)基是目前最安全、最為理想的無血清細胞培養(yǎng)基，所有成份的濃度都完全明確，即使其所添加的少量蛋白，也是可經過純化處理，成份明確、濃度確定的蛋白。這類培養(yǎng)基較為理想地減少了生產的可變性，提高了生產工藝的重復性，并有效降低了純化成本。

  1.6 個性化細胞培養(yǎng)基

  嚴格意義上來說，個性化細胞培養(yǎng)基不在細胞培養(yǎng)基的傳統(tǒng)分類之列，其具體是指一類根據(jù)細胞特性、細胞培養(yǎng)工藝特點、使用者需求習慣而量身定制的細胞培養(yǎng)基，主要目的是提高細胞產率、產品質量、產品安全性和降低血清的使用等。個性化細胞培養(yǎng)基可能是無血清培養(yǎng)基，也可能是低血清培養(yǎng)基，最終是為滿足某一種或某一類生物制品的生產需求。

  2. 培養(yǎng)基的基本組分

  細胞培養(yǎng)基必須含有充分的營養(yǎng)物質，才能滿足新細胞合成、細胞代謝等生化反應所需要的物質和能量。細胞培養(yǎng)基的主要成份是水、氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助營養(yǎng)物質等。此外，還可能含有血清、血清替代成分、pH指示劑等。

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